Caracterización del microbioma digestivo de una línea de conejo sometida a dos tratamientos alimentarios diferentes

[EN] Feed restriction during the fattening period is a widespread method of management that is favorable for animal health because it reduces the risk of digestive problems such as mucoid enteropathy. Although feed restriction penalizes animal growth, it improves feed efficiency and reduces environmental impact, feeding costs and the use of antibiotics. Feeding restriction modifies gastrointestinal bacterial fermentation pattern and therefore it could change the micr obial composition and activity. The aim of this thesis is the characterization of caecal and faecal microbial communities that belong to two groups of meat rabbits which were fed with different intake levels during the fatting period, as well as to study t he existence of possible associations of some microorganisms with growth. Total DNA from caecum and faeces – belonging t 24 Caldes line rabbits; 11 fed ad libitum and 13 under restriction - was extracted with a bead - beating kit. A 411 bases fragment correspo nding to the hypervariable regions V4 and V5 of the 16S rRNA gene was amplified. Libraries of the 48 samples were generated following manufacturer’s instructions of kit Nextera® XT and then sequenced in parallel in a MiSeq Illumina sequencer. Readings gene rated were analyzed with the bioinformatic package QIIME yielding a table that includes the normalized abundances of 1.823 OTUs. A linear model was implemented to study the effects of feeding treatment, the origin of the sample and the interaction of both on the relative abundance of bacteria at different taxonomic levels: OTU, family and phylum. A principal coordinate analysis (PCoA) was performed from weighted Unifrac phylogenetic distance matrix. A linear model was also used to study the effect of microb ial composition on average daily gain (ADG) and weight at 31 days of life (P31). Finally, the effect of microbial diversity on ADG was studied with a linear model in which the explanatory factors were the feeding treatment and the regression on number of o bserved OTUs. The sequencing process generated 5.820.828 readings with large variability between samples (range=40.025 - 240.333) which after filtering yielded 2.195.158 contigs. Rarefaction curves obtained for diversity index showed no difference between th e levels of the combination feeding treatment - origin of the sample. This analysis detected four samples clearly separated from the rest. The taxonomic characterization of the samples revealed that the dominant phyla were Firmicutes (76,31%), Bacteroidetes (7,61%) and Tenericutes (7,52%); last one hadn’t been described in the literature before. A unique genus of the kingdom Archaea ( Methanobrevibacter ) was presented (0,65‰). Although the PCoA analysis did not show a clear pattern of separation between sample s depending on the combination of feeding treatment - origin; when the effect of the origin of the sample on the microbial composition was analyzed, significant differences were found for phyla Actinobacteria and Cyanobacteria ; for families Lachnospiraceae , Clostridiaceae , Coriobacteriaceae , an unknown family belonging to phylum Proteobacteria and an unknown family belonging to orde r YS2 ( Cyanobacteria ). When the effect of feeding regimen on the microbial composition was studied, significant differences were found for phyla Cyanobacteria and Tenericutes ; for an unknown family belonging to order YS2 and for an unknown xv family belonging to order RF39 ( Tenericutes ). PCoA showed that four atypical samples had a microbial composition different from the rest and evid enced significant differences for 6 phyla and 27 families. In addition, 9 OTU - classified within families Ruminococcaceae and Lachnospiraceae from phylum Firmicutes - were exclusive of them. Although the microbial composition of these 4 samples is not typic al of animals affected by enteropathy, one of them was diagnosed with enteric problems during the fattening period. The association study between microbial composition and average daily gain, showed a negative association for the family Mogibacteriaceae (o rder Clostridiales ) and a positive association for one OTU of unknown family belonging to the order Clostridiales . The study of association between ADG and the number of observed OTUs was only significant for the group of animals fed under restriction show ing a positive association between diversity and ADG. This study has tuned up MiSeq sequence technology for the study of microbial composition of caecal and faecal rabbit samples, we have also developed a pipeline based on the software QIIME. These achieve ments have allowed a preliminary study of the effect of feeding treatment and the origin of the samples on the microbial composition and its influence on growth.

La restricción alimentaria durante el cebo es un método de manejo favorable para la salud del animal pues reduce el riesgo de aparición de problemas digestivos tales como la enteropatía mucoide. Aunque penaliza el crecimiento del animal mejora la eficiencia alimentaria, reduce el impacto medioambiental y disminuye los costes del pienso y del uso de antibióticos. El racionamiento modifica el perfil de fermentación bacteriano gastrointestinal y, por tanto, podría también modificar la composición y actividad microbianas. El objetivo de esta tesis es la caracterización de las comunidades microbianas cecal y fecal de dos grupos de conejos que fueron alimentados con distinto nivel de ingesta durante el periodo de engorde, y estudiar la asociación de estas comunidades con el crecimiento. Para ello se extrajo, con un kit de tipo bead-beating, el DNA total del ciego y de las heces de 24 animales de la línea Caldes, 13 alimentados bajo restricción y 11 a voluntad. De las 48 muestras, se amplificó un fragmento de 411 bases del gen 16S rRNA (regiones V4 y V5). Siguiendo el protocolo del kit Nextera® XT se generaron las librerías que fueron secuenciadas en paralelo en un secuenciador Illumina MiSeq. Las lecturas generadas fueron analizadas con el paquete bioinformático QIIME obteniéndose una tabla de abundancias normalizadas de 1.823 OTUs. Se empleó un modelo lineal para estudiar los efectos del régimen alimentario, el origen de la muestra y la interacción de ambos sobre la abundancia relativa a nivel taxonómico de OTU, familia y filo. Se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) de la matriz de distancia filogenética Unifrac ponderada. También se empleó un modelo lineal para estudiar el efecto de la composición microbiana sobre los caracteres ganancia media diaria (GMD) y peso ajustado a 31 días de edad (P31). Finalmente, se estudió el efecto de la diversidad microbiana sobre la GMD con un modelo lineal en el que los factores explicativos fueron el tratamiento alimentario y la regresión sobre el número de OTUs observados. El proceso de secuenciación generó un total de 5.820.828 lecturas con gran variabilidad entre muestras (rango=40.025-240.333) que, tras el filtrado de calidad, fueron agrupadas en 2.195.158 contigs. Las curvas de rarefacción obtenidas para los índices de diversidad no mostraron diferencias entre los niveles de la combinación, régimen alimentario-origen de la muestra. En este análisis se detectaron 4 muestras que se separaban claramente del resto. La caracterización taxonómica de las muestras reveló que los filos predominantes son Firmicutes (76,31%), Bacteroidetes (7,61%) y Tenericutes (7,52%); este último no había sido descrito previamente en la literatura. Se identificó un único género del reino Archaea (Methanobrevibacter) con una abundancia del 1‰. A pesar de que el análisis PCoA no mostró un patrón claro de separación entre las muestras en función de la combinación entre origen y tratamiento, cuando se analizó el efecto del origen de la muestra sobre la composición microbiana se encontraron diferencias significativas para los filos Cyanobacteria y Actinobacteria; para las familias Lachnospiraceae, Clostridiaceae, Coriobacteriaceae, una familia no clasificable del filo Proteobacteria y una familia desconocida del orden YS2 perteneciente al filo Cyanobacteria. Cuando se estudió el efecto del régimen alimentario sobre el microbioma de ciego y heces se encontraron diferencias significativas para los filos Cyanobacteria y Tenericutes; para una familia desconocida del orden YS2 y para una familia desconocida del orden RF39 (filo Tenericutes). El PCoA evidenció 4 muestras con una composición microbiana claramente diferentes al resto, estas muestras atípicas mostraron diferencias significativas para 6 filos y 27 familias. Además, 9 OTUs –clasificados dentro de las familias Ruminococcaceae y Lachnospiraceae del filo Firmicutes- resultaron exclusivos de ellas. Aunque la composición microbiológica de dichas muestras no es propia de animales enfermos de enteropatía, uno de ellos fue diagnosticado con problemas entéricos durante el engorde. El estudio de asociación entre la composición microbiana y la ganancia media diaria mostró una asociación negativa con el crecimiento para la familia Mogibacteriaceae (orden Clostridiales) y una asociación positiva para un OTU de familia desconocida del orden Clostridiales. El estudio de asociación entre GMD y el número de OTU observados mostró una asociación positiva entre la diversidad y la GMD para el grupo de animales alimentado bajo restricción. Con este estudio, se ha puesto a punto de la tecnología de secuenciación MiSeq de Illumina de contenido cecal y heces de conejo y se ha desarrollado un protocolo de filtrado de calidad y análisis de las muestras con el software QIIME, lo que ha permitido un estudio preliminar del efecto del régimen alimentario y el origen de la muestras sobre la composición microbiana y cómo esta influye sobre el crecimiento.